Les tableaux ci-dessous présentent la majorité des problèmes et des solutions correspondantes, rencontrés au cours des expériences de PCR.

Pour gagner du temps lors de l’optimisation de la configuration de la PCR, il est recommandé d’utiliser Ammonium Buffer pour la plupart des applications PCR. Le tampon Ammonium est un tampon PCR 10x hautement fiable, qui produit une grande quantité de produits PCR tout en minimisant le besoin d’optimiser la concentration de Mg2+ et/ou les cycles de températures.

Le produit PCR n’a pas la bonne taille

CAUSES POSSIBLES SOLUTIONS
Contamination par les nucléases Réessayez avec des réactifs frais
Mauvais amorçage Tester que les amorces n’ont pas de régions complémentaires supplémentaires dans la matrice d’ADN
Concentration de MgCl2 non optimale Ajuster la concentration de MgCl2 comme indiqué dans la fiche technique du produit
Température d’hybridation non optimale Retester les valeurs Tm des amorces

 

Absence de produit PCR

CAUSES POSSIBLES SOLUTIONS
Faible spécificité d’amorce Vérifier que les amorces sont complémentaires à la séquence cible correcte
Concentration d’amorce trop faible Ajuster dans la plage 0.1 – 1 µM
Conditions de réaction sous-optimales Optimiser la température d’annealing en exécutant un gradient de température
Ajuster la concentration de MgCl2 comme indiqué dans la fiche technique du produit
Mauvaise qualité de l’échantillon Testez l’ADN en utilisant l’électrophorèse sur gel avant et après l’ajout de MgCl2
Vérifiez le rapport 260/280 de la matrice d’ADN
Manque un composant de réaction Faire un nouveau mix PCR
Inhibiteurs de la réaction Assurez-vous que la matrice d’ADN est purifiée ou diminuez le volume de l’échantillon
L’exécution de la PCR n’est pas optimale Ajouter plus de cycles
Revérifier le programme PCR
Recalibrer le bloc chauffant
Votre échantillon ou la cible est complexe Pour les séquences riches en GC ou d’autres cibles d’ADN complexes, optimisez les conditions à l’aide du kit cible riche en GC

 

Smears ou bande multiple sur le gel

CAUSES POSSIBLES SOLUTIONS
Réplication prématurée Utilisez plutôt l’ADN polymérase TEMPase Hot Start
Préparez la réaction PCR dans la glace
Température d’annealing trop basse Augmenter la température d’annealing
Si vous n’utilisez pas déjà le tampon d’Ammonium, passez à ce tampon
Excès d’amorces Ajuster dans la plage 0.1 – 1 µM
Concentration de MgCl2 non optimale Ajuster la concentration de MgCl2 comme indiqué dans la fiche technique du produit
Conception d’amorce non optimale Assurez-vous que les amorces ne sont pas complémentaires
Augmenter la longueur des amorces
Éviter les extrémités 3′ riches en GC
Contamination par de l’ADN non matrice Utilisez toujours des pointes de filtre, de l’eau de qualité PCR
Utilisez des zones séparées pour la configuration de la réaction PCR, la préparation de l’ADN, le cycle de température PCR et l’électrophorèse sur gel
Concentration de modèle incorrecte Ajustez la concentration de l’échantillon comme indiqué dans la fiche technique du produit

 

Erreurs de séquence

CAUSES POSSIBLES SOLUTIONS
Polymérase basse fidélité Utiliser l’ADN polymérase AccuPOL avec un tampon d’ammonium
L’échantillon d’ADN a été endommagé Préparer une nouvelle matrice d’ADN
Limiter l’exposition de l’ADN matrice aux UV
Temps de chauffage initial réduit
Conditions de réaction sous-optimales Diminuer le temps d’extension
Diminuer la concentration de MgCl2
Réduire le nombre de cycles
Problèmes avec la composition des nucléotides Faire une nouvelle solution de mélange de nucléotides

 

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