Les tableaux ci-dessous présentent la majorité des problèmes et des solutions correspondantes, rencontrés au cours des expériences de PCR.
Pour gagner du temps lors de l’optimisation de la configuration de la PCR, il est recommandé d’utiliser Ammonium Buffer pour la plupart des applications PCR. Le tampon Ammonium est un tampon PCR 10x hautement fiable, qui produit une grande quantité de produits PCR tout en minimisant le besoin d’optimiser la concentration de Mg2+ et/ou les cycles de températures.
Le produit PCR n’a pas la bonne taille
| CAUSES POSSIBLES | SOLUTIONS |
| Contamination par les nucléases | Réessayez avec des réactifs frais |
| Mauvais amorçage | Tester que les amorces n’ont pas de régions complémentaires supplémentaires dans la matrice d’ADN |
| Concentration de MgCl2 non optimale | Ajuster la concentration de MgCl2 comme indiqué dans la fiche technique du produit |
| Température d’hybridation non optimale | Retester les valeurs Tm des amorces |
Absence de produit PCR
| CAUSES POSSIBLES | SOLUTIONS |
| Faible spécificité d’amorce | Vérifier que les amorces sont complémentaires à la séquence cible correcte |
| Concentration d’amorce trop faible | Ajuster dans la plage 0.1 – 1 µM |
| Conditions de réaction sous-optimales | Optimiser la température d’annealing en exécutant un gradient de température Ajuster la concentration de MgCl2 comme indiqué dans la fiche technique du produit |
| Mauvaise qualité de l’échantillon | Testez l’ADN en utilisant l’électrophorèse sur gel avant et après l’ajout de MgCl2 Vérifiez le rapport 260/280 de la matrice d’ADN |
| Manque un composant de réaction | Faire un nouveau mix PCR |
| Inhibiteurs de la réaction | Assurez-vous que la matrice d’ADN est purifiée ou diminuez le volume de l’échantillon |
| L’exécution de la PCR n’est pas optimale | Ajouter plus de cycles Revérifier le programme PCR Recalibrer le bloc chauffant |
| Votre échantillon ou la cible est complexe | Pour les séquences riches en GC ou d’autres cibles d’ADN complexes, optimisez les conditions à l’aide du kit cible riche en GC |
Smears ou bande multiple sur le gel
| CAUSES POSSIBLES | SOLUTIONS |
| Réplication prématurée | Utilisez plutôt l’ADN polymérase TEMPase Hot Start Préparez la réaction PCR dans la glace |
| Température d’annealing trop basse | Augmenter la température d’annealing Si vous n’utilisez pas déjà le tampon d’Ammonium, passez à ce tampon |
| Excès d’amorces | Ajuster dans la plage 0.1 – 1 µM |
| Concentration de MgCl2 non optimale | Ajuster la concentration de MgCl2 comme indiqué dans la fiche technique du produit |
| Conception d’amorce non optimale | Assurez-vous que les amorces ne sont pas complémentaires Augmenter la longueur des amorces Éviter les extrémités 3′ riches en GC |
| Contamination par de l’ADN non matrice | Utilisez toujours des pointes de filtre, de l’eau de qualité PCR Utilisez des zones séparées pour la configuration de la réaction PCR, la préparation de l’ADN, le cycle de température PCR et l’électrophorèse sur gel |
| Concentration de modèle incorrecte | Ajustez la concentration de l’échantillon comme indiqué dans la fiche technique du produit |
Erreurs de séquence
| CAUSES POSSIBLES | SOLUTIONS |
| Polymérase basse fidélité | Utiliser l’ADN polymérase AccuPOL avec un tampon d’ammonium |
| L’échantillon d’ADN a été endommagé | Préparer une nouvelle matrice d’ADN Limiter l’exposition de l’ADN matrice aux UV Temps de chauffage initial réduit |
| Conditions de réaction sous-optimales | Diminuer le temps d’extension Diminuer la concentration de MgCl2 Réduire le nombre de cycles |
| Problèmes avec la composition des nucléotides | Faire une nouvelle solution de mélange de nucléotides |
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Extrait de la gamme AmpliqonDécouvrez la gamme Ampliqon |
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